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产品名称：Duck Adenovirus鸭腺病毒染料法荧光定量PCR试剂盒（暂停）

本产品是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的PCR试剂盒，它具有下列特点：

 1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。 

2.引物等组分经过优化，灵敏度高。

 3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

 4.特异性高，引物是根据高度保守区设计，不会跟其他的DNA/RNA发生交叉反应。

 5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

 6.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。

包装规格及成分（具体信息详见说明书）：

 

 

Duck Adenovirus鸭腺病毒染料法荧光定量PCR试剂盒（暂停）操作过程：

 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

 1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。

二、DNA提取：

 可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。

1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。

4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。

三、数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理：

1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。

2. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

Duck Adenovirus鸭腺病毒染料法荧光定量PCR试剂盒（暂停）样本采集、存放及运输：

1、样本采集：各类型样本按照常规方法采集；

2、运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限一年。阳性对照需单独放置，不要污染其他试剂。

3、运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。

4、自备试剂：样品DNA。

盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。 

【参考值（参考范围）】

1.试剂盒有效性判定：

（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。

（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

2.标本结果判定：

（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。

（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。

Duck Adenovirus鸭腺病毒染料法荧光定量PCR试剂盒（暂停）注意事项  

1.使用本试剂盒的实验室，应严格按照国家有关部分颁布的有关基因扩增检验实验室管理规范进行管理；

2.为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理；

3.各区域物品均为专用，不得交叉使用，以污染；检测结束后，应立即对工作台清洁；

4.吸取反应液时，应尽量避免产生气泡；上 PCR 仪前，应注意检查各反应管是否盖紧，以免液体蒸发造成结果不准确；

5.试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心；

6.试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放；

7.为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记；

8.检测过程中使用过的吸头，应直接打到盛有 10%次氯酸的废物缸内，检测结束的PCR 反应管，切忌开盖，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃；工作台及各种实验用品应定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外灯进行消毒；

9.仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用；并在有效期内使用。

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