原理：实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
●操作步骤
1 、RNA抽提
2、RT –pcr
| PCR反应体系 |
| 反应成分 | 体积(ul) |
| 10×dNTP | 4 |
| 10×Buffer | 5 |
| 酶 | 0.4 |
| 模板 | 1 |
| 引物 | 1 |
| ddH2O | 38.6 |
表2-2 PCR反应条件| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 95℃ | 5s | 1 |
| 95℃ | 30s | |
| 66.5℃ | 30s | 35 |
| 72℃ | 15s | |
| 72℃ | 15s | 1 |
| 4℃ | ∞ | |
3 实时荧光定量PCR
DNA Polymerase DNA聚合酶
v dNTP 四种脱氧核苷酸
Buffer 缓冲溶液 Mix
rox 内参染料
SYBR GreenⅠ 荧光染料
v Primer F/R 引物（上游/下游）
v Template 模板
反应条件：
95℃，10min；
95℃，15sec，
60℃，30sec，
72℃，30sec，
反应结束后，立即进行溶解曲线分析。
95℃，15sec，
60℃，60sec，
95℃，15sec，
60℃，15sec。
l 数据分析（结果分析）
扩增曲线 溶解曲线
●常见问题分析：
| 检测荧光信号的步骤有误: 一般 SG 法采用 72℃延伸时采集。
引物或探针降解: 可通过 PAGE电泳检测其完整性。
模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 |
| Ct 值出现过晚 | 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
PCR 产物太长: 一般采用 80-150bp 的产物长度。
PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
模板量低。 |
| 阴性对照有信号 | Mix或水被污染。
如使用ROX校正，则可能为ROX 降解所致。
引物二聚体的出现：35循环后出现属正常，配合熔解曲线进行分析提高退火温度；降低引物浓度；冰上操作；重新设计引物 |
| 溶解曲线不止一个主峰 | 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。 |
| 重复性差 | 1.加样不准确。
2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。
3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。 |
| 扩增曲线异常 | 基线设置有误。
高浓度的模板会导致CT值过早出现，即基线范围变小，导致机器读取荧光数值有误 |
| 扩增熔解曲线不同，ct值却相同 | 模板起始浓度相同，扩增效率不同。 |
| 预实验时为单峰，正式时为杂峰 | 引物有问题：使用另一对引物则为特异性扩增。 |
●特点：
1、特异性好,使用特异性
探针对定量分子进行识别,具有很高的准确性.同时,靶序列由
引物和探针双重控制,特异性好、假阳性低.
2、灵敏度高,荧光
PCR检测技术是综合了
PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术,因此它的检测灵敏度很高.
3、线性关系好、线性范围宽,由于
荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接对产物进行
定量;定量范围可在 0-1010拷贝/毫升.
4、操作简单、安全、自动化程度高、防污染.扩增和检测可以在同一管内检测,不需要开盖,不易污染;同时扩增和检测一步完成,不需要后期处理,不再需要担心放射性污染.
●注意事项：
1、为保证实验的精确性，请客户在取样前与我们取得联系，我公司会派专人去协助取样；客户也可直接提供纯化好的总RNA/DNA（≥ 3 ug/ 样本）。
2、请通过 E-mail 提供已知的全长基因序列。
3、希望提供详细的背景资料：生物物种信息，DNA/ RNA来源、基因丰度等。
●服务流程
1、 根据客户提供的信息设计实验。
2、 出具实验报告以及图表
●检测项目：
| 检测种类 | 核酸种类 | 产品名称 | 规格 | | 肝炎类 | DNA类 | 乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） | 20人份/盒 | | DNA类 | 乙型肝炎病毒(HBV)基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法） | 10人份/盒 | | DNA类 | 乙型肝炎病毒(HBV)YMDD基序突变检测试剂盒(PCR反向点杂交法) | 10人份/盒 | | DNA类 | 乙型肝炎病毒(HBV)前C区BCP区突变检测试剂盒(PCR-反向点杂交法) | 10人份/盒 | | RNA类 | 丙型肝炎病毒(HCV)核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） | 10人份/盒 | | RNA类 | 丙型肝炎病毒(HCV)基因分型检测试剂盒（PCR-荧光探针法） | 10人份/盒 | | 性病类 | DNA类 | 沙眼衣原体(CT)核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） | 20人份/盒 | | DNA类 | 淋球菌（NGH）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒 | 20人份/盒 | | DNA类 | 解脲脲(UU)原体核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒 | 20人份/盒 | | DNA类 | 人乳头瘤病毒（6，11型）(HPV6,11)核酸定量检测试剂盒（PCR荧光法） | 20人份/盒 | | DNA类 | 单纯疱疹病毒II型(HSV II)核酸扩增（PCR）荧光定量测定试剂盒 | 20人份/盒 | | RNA类 | 人类免疫缺陷病毒1型(HIV I)核酸定量检测试剂盒（巢式PCR-荧光法） | 10人份/盒 | | DNA类 | 解脲脲原体基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法) | 10人份/盒 | | 优生优育类 | DNA类 | 人巨细胞病毒(HCMV)核酸扩增荧光定量检测试剂盒 | 20人份/盒 | | 呼吸道类 | DNA类 | 结核分支杆菌(TB)核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒 | 20人份/盒 | | RNA类 | 甲型流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） | 24人份/盒 | | DNA类 | 肺炎支原体(MP)核酸定量检测试剂盒（PCR荧光探针法） | 20人份/盒 | | RNA类 | 呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) | 10人份/盒 | | 消化道类 | RNA类 | 柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) | 24人份/盒 | | RNA类 | 肠道病毒通用型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) | 24人份/盒 | | RNA类 | 肠道病毒71型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) | 24人份/盒 | | DNA类 | 幽门螺旋杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) | 20人份/盒 | | 肿瘤类 | DNA类 | EB病毒核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒 | 10人份/盒 | | DNA类 | 高危型人乳头瘤病毒（8个型）(HR-HPV 8)核酸定量检测试剂盒（PCR荧光法） | 20人份/盒 | | DNA类 | 人乳头瘤病毒（16、18型）(HPV16,18)核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒 | 20人份/盒 | | DNA类 | 人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法(RDB)) | 20人份/盒 | | 遗传疾病类 | DNA类 | α-地中海贫血基因诊断试剂盒（gap-PCR法） | 20人份/盒 | | DNA类 | β-地中海贫血基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法） | 10人份/盒 | | DNA类 | 21-三体和性染色体多倍体检测试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法） | 50人份/盒 |
常见PCR检测项目表 |
